一、原理
生化需氧量是指在規(guī)定條件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物質(zhì)，主要是有機(jī)物質(zhì)所進(jìn)行的生物化學(xué)過程中消耗溶解氧的量。分別測定水樣培養(yǎng)前的溶解氧含量和在20±1℃培養(yǎng)五天后的溶解氧含量，二者之差即為五日生化過程所消耗的氧量（BOD5）。
二、儀器
1．恒溫培養(yǎng)箱。
2．5—20L細(xì)口玻璃瓶。
3．1000—2000mL量筒。
4．玻璃攪棒：棒長應(yīng)比所用量筒高度長20cm。在棒的底端固定一個(gè)直徑比量筒直徑略小，并帶有幾個(gè)小孔的硬橡膠板。
5．溶解氧瓶：200—300mL，帶有磨口玻璃塞并具有供水封用的鐘形口。
6．虹吸管：供分取水樣和添加稀釋水用。
三、試劑
1．磷酸鹽緩沖溶液：將8.5g磷酸二氫鉀（KH2PO4），21.75g磷酸氫二鉀(K2HPO4)，33.4g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2O)和1.7g氯化銨(NH4Cl)溶于水中，稀釋至1000mL。此溶液的pH應(yīng)為7.2。
2．硫酸鎂溶液：將22.5g硫酸鎂 (MgSO4·7H2O) 溶于水中，稀釋至1000mL。
3．氯化鈣溶液：將 27.5g無水氯化鈣溶于水，稀釋至1000mL。
4．氯化鐵溶液：將0.25g氯化鐵(FeCl3·6H2O)溶于水，稀釋至1000mL。
5．鹽酸溶液(0.5mol/L):將40mL(ρ=1.18g/mL)鹽酸溶于水中，稀釋至100mL。
6．氫氧化鈉溶液(0.5mol/L)：將20g氫氧化鈉溶于水，稀釋至1000mL。
7．亞硫酸鈉溶液(c1/2Na2SO3=0.025mol/L)：將1.575g亞硫酸鈉溶于水，稀釋至1000mL。此溶液不穩(wěn)定，需每天配制。
8．葡萄糖-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：將葡萄糖(C6H12O6)和谷氨酸(HOOC－CH2－CH2－CHNH2－COOH)在103℃干燥1h，各稱取150mg溶于水中，移入1000mL容量瓶內(nèi)并稀釋至標(biāo)線,混合均勻。此標(biāo)準(zhǔn)溶液臨用前配制。
9．稀釋水：在5—20L玻璃瓶內(nèi)裝入一定量的水，控制水溫在20℃左右。然后用無油空氣壓縮機(jī)或薄膜泵，將此水暴氣2—8h，使水中的溶解氧接近于飽和，也可以鼓入適量純氧。瓶口蓋以兩層經(jīng)洗滌晾干的紗布，置于20℃培養(yǎng)箱中放置數(shù)小時(shí)，使水中溶解氧含量達(dá)8mg/L左右。臨用前于每升水中加入氯化鈣溶液、氯化鐵溶液、硫酸鎂溶液、磷酸鹽緩沖溶液各1mL，并混合均勻。
稀釋水的PH值應(yīng)為7.2，其BOD5應(yīng)小于0.2mg/L。
10．接種液：根據(jù)所取水樣用不同的方法獲取適用的接種液。
11．接種稀釋水：取適量接種液，加于稀釋水中，混勻。每升稀釋水中接種液加入量生活污水為1—10mL，表層土壤浸出液為20—30mL；河水、湖水為10—100mL。
接種稀釋水的pH值應(yīng)為7.2，BOD5值以在0.3—1.0mg/L之間為宜。接種稀釋水配制后應(yīng)立即使用。
四、測定步驟
1．水樣的預(yù)處理
（1）水樣的pH值若超出6.5—7.5范圍時(shí)，可用鹽酸或氫氧化鈉稀溶液調(diào)節(jié)至近于7，但用量不要超過水樣體積的0.5%。若水樣的酸度或堿度很高，可改用高濃度的堿或酸液進(jìn)行中和。
(2)水樣中含有銅、鉛、鋅、鎘、鉻、砷、氰等有毒物質(zhì)時(shí)，可使用經(jīng)馴化的微生物接種液的稀釋水進(jìn)行稀釋，或增大稀釋倍數(shù)，以減小毒物的濃度。
(3)含有少量游離氯的水樣，一般放置1—2h，游離氯即可消失。對(duì)于游離氯在短時(shí)間不能消散的水樣，可加入亞硫酸鈉溶液，以除去之。其加入量的計(jì)算方法是：取中和好的水樣100mL，加入1+1乙酸10mL，10%（m/V）碘化鉀溶液1mL,混勻。以淀粉溶液作指示劑，用亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定游離碘。根據(jù)亞硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積及其濃度，計(jì)算水樣中所需加亞硫酸鈉溶液的量。
(4)從水溫較低的水域中采集的水樣，可遇到含有過飽和溶解氧，此時(shí)應(yīng)將水樣迅速升溫至20℃左右，充分振搖，以趕出過飽和的溶解氧。
從水溫較高的水域或廢水排放口取得的水樣，則應(yīng)迅速使其冷卻至20℃左右，并充分振搖，使與空氣中氧分壓接近平衡。
2．水樣的測定
（1）不經(jīng)稀釋水樣的測定：溶解氧含量較高、有機(jī)物含量較少的地面水，可不經(jīng)稀釋，而直接以虹吸法將約20℃的混勻水樣轉(zhuǎn)移至兩個(gè)溶解氧瓶內(nèi)，轉(zhuǎn)移過程中應(yīng)注意不使其產(chǎn)生氣泡。以同樣的操作使兩個(gè)溶解氧瓶充滿水樣，加塞水封。
立即測定其中一瓶溶解氧。將另一瓶放入培養(yǎng)箱中，在20±1℃培養(yǎng)5d后。測其溶解氧。
（2）需經(jīng)稀釋水樣的測定
稀釋倍數(shù)的確定：地面水可由測得的高錳酸鹽指數(shù)乘以適當(dāng)?shù)南禂?shù)求出稀釋倍數(shù)（見下表）。
高錳酸鹽指數(shù)（mg/L）
系 數(shù)
＜5
5—10
10—20
＞20
——
0.2、0.3
0.4、0.6
0.5、0.7、1.0
工業(yè)廢水可由重鉻酸鉀法測得的COD值確定。通常需作三個(gè)稀釋比，即使用稀釋水時(shí)，由COD值分別乘以系數(shù)0.075、0.15、0.225，即獲得三個(gè)稀釋倍數(shù)；使用接種稀釋水時(shí)，則分別乘以0.075、0.15和0.25，獲得三個(gè)稀釋倍數(shù)。
稀釋倍數(shù)確定后按下法之一測定水樣。
①一般稀釋法：按照選定的稀釋比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀釋水（或接種稀釋水）于1000mL量筒中，加入需要量的均勻水樣，再引入稀釋水（或接種稀釋水）至800mL，用帶膠板的玻璃棒小心上下攪勻。攪拌時(shí)勿 使攪棒的膠板露出水面，防止產(chǎn)生氣泡。
按不經(jīng)稀釋水樣的測定步驟，進(jìn)行裝瓶，測定當(dāng)天溶解氧和培養(yǎng)5d后的溶解氧含量。
另取兩個(gè)溶解氧瓶，用虹吸法裝滿稀釋水（或接種稀釋水）作為空白，分別測定5d前、后的溶解氧含量。
②直接稀釋法：直接稀釋法是在溶解氧瓶內(nèi)直接稀釋。在已知兩個(gè)容積相同（其差小于1mL）的溶解氧瓶內(nèi)，用虹吸法加入部分稀釋水（或接種稀釋水），再加入根據(jù)瓶容積和稀釋比例計(jì)算出的水樣量，然后引入稀釋水（或接種稀釋水）至剛好充滿，加塞，勿留氣泡于瓶內(nèi)。其余操作與上述稀釋法相同。
在BOD5測定中，一般采用疊氮化鈉改良法測定溶解氧。如遇干擾物質(zhì)，應(yīng)根據(jù)具體情況采用其它測定法。溶解氧的測定法附后。
五、計(jì)算
1．不經(jīng)稀釋直接培養(yǎng)的水樣
BOD5(mg/L)=c1－c2
式中：c1——水樣在培養(yǎng)前的溶解氧濃度(mg/L);
c2——水樣經(jīng)5d培養(yǎng)后，剩余溶解氧濃度(mg/L);
2．經(jīng)稀釋后培養(yǎng)的水樣
BOD5(mg/L)= ( (c1–c2)–(B1–B2)f1)/f2
式中：B1——稀釋水（或接種稀釋水）在培養(yǎng)前的溶解氧濃度(mg/L);
B2——稀釋水（或接種稀釋水）在培養(yǎng)后的溶解氧濃度(mg/L);
f1——稀釋水（或接種稀釋水）在培養(yǎng)液中所占比例；
f2——水樣在培養(yǎng)液中所占比例。
注意事項(xiàng)
1．測定一般水樣的BOD5時(shí)，硝化作用很不明顯或根本不發(fā)生。但對(duì)于生物處理池出水，則含有大量硝化細(xì)菌。因此，在測定BOD5時(shí)也包括了部分含氮化合物的需氧量。對(duì)于這種水樣，如只需測定有機(jī)物的需氧量，應(yīng)加入硝化抑制劑，如丙烯基硫脲（ATU,C4H8N2S）等。
2．在兩個(gè)或三個(gè)稀釋比的樣品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L和剩余溶解氧大于1mg/L都有效，計(jì)算結(jié)果時(shí)，應(yīng)取平均值。
3．為檢查稀釋水和接種液的質(zhì)量，以及化驗(yàn)人員的操作技術(shù)，可將20mL葡萄糖-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用接種稀釋水稀釋至1000mL，測其BOD5，其結(jié)果應(yīng)在180—230mg/L之間。否則，應(yīng)檢查接種液、稀釋水或操作技術(shù)是否存在問題。